luciferase 分子生物学专题—Luciferase核心实验技术:实验原理

荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够产生生物发光的酶的统称,不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。萤光生成反应通常分为以下两步:萤光素+atp→萤光素化腺苷酸(luciferyladenylate)+ P

luciferase 分子生物学专题—Luciferase核心实验技术:实验原理

荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够产生生物发光的酶的统称,不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。

萤光生成反应通常分为以下两步:

萤光素+atp→萤光素化腺苷酸(luciferyladenylate)+ PPi

萤光素化腺苷酸+ O2→氧萤光素+ AMP +光

荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中,将不同类型的细胞(骨髓干细胞、T细胞等)标记上(即表达)荧光素酶,就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光,而发出的光子可以被光敏感元件,如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。

荧光素酶分析可应用于启动子研究中分析顺式作用元件和反式作用因子、药物筛选、sirna和miRNA筛选、分泌途径及蛋白定位报告基因检测、活细胞的实时动态研究、信号转导通路分析、难转染的细胞(包括干细胞和原代细胞)的研究、RNA剪接研究。

萤光素酶是理想的报告基因,因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶,一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响,而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线,从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响,使得数据结果更为可信。Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶,两者没有种源同源性并对应不同的反应底物,故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比,本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式因子,转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。萤光素酶报告基因实验(luciferase Assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段,其原理简述如下:

(1)用靶启动子的特定片段替换报告基因质粒(如pGL3-basic)的启动子区。

(2)将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转。如果该转录因子能够激活靶启动子,则萤光素酶就会表达,且其表达量与转录因子的作用强度成正比。

(3)加入特定的底物,萤光素酶与底物反应,产生萤光素,检测荧光的强度可以对萤光素酶的活性定量,进而判断该转录因子能否与靶启动子片段发生作用(及其作用强度)。

双荧光素酶报告基因测试,是结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速、灵敏、简便。其应用广泛,可同时分析多个调控元件、同时分析多个信号转导通路、单次筛选一个以上的靶点(包括脱靶效应、分析两个或多个通路之间的相互作用)。

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图2 常用载体

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