基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤

第一步:目的基因的获取1、目的基因是指:编码蛋白质的结构基因。2、原核基因采取直接分离获得,真核基因是人工合成.人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。3、PCR技术扩增目的基因(1)原理:DNA双链复制(2)过程:①:加热至90

基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤

第一步:目的基因的获取

1、目的基因是指:编码蛋白质的结构基因。

2、原核基因采取直接分离获得,真核基因是人工合成.人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

3、PCR技术扩增目的基因

(1)原理:DNA双链复制

(2)过程:

①:加热至90~95℃DNA解链;

②:冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;

③:加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

第二步:基因表达载体的构建

1.目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因

(1)启动子:是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。

(2)终止子:也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端。

(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来.常用的标记基因是抗生素基因。

第三步:将目的基因导入受体细胞

1.转化的概念:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法:

①、将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等;

②、将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术.此方法的受体细胞多是受精卵;

③、将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是:先用Ca2+处理细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。

3.重组细胞导入受体细胞后,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步:目的基因的检测和表达

1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术。

2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。

3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。

4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定,如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

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